ChIP是一種發(fā)展很快的研究技術(shù)，主要應(yīng)用于確定細(xì)胞內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，這一點(diǎn)對(duì)正確的基因調(diào)控尤為重要。ChIP在表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域正被逐漸應(yīng)用于藥物研發(fā)中的分子機(jī)制研究、分層醫(yī)學(xué)、診斷學(xué)以及將ChIP與第二代測(cè)序相結(jié)合的ChIP-seq技術(shù)中。

當(dāng)您在為遇到上述的問題食不知味、夜不能寐、山重水復(fù)疑無路時(shí)，不妨看看英國ChIP實(shí)驗(yàn)專家Chromatrap?提供的Top 10 tips錦囊，或許能柳暗花明又一村！

一個(gè)成功的ChIP實(shí)驗(yàn)很大程度上依賴于所制備的染色質(zhì)的質(zhì)量。染色質(zhì)制備 重要的三個(gè)方面包括：裂解、交聯(lián)、片段化。每一個(gè)步驟都應(yīng)該被獨(dú)立地優(yōu)化以合適地還原所研究的生物過程。請(qǐng)閱讀以下在染色質(zhì)制備中的相關(guān)技巧。

染色質(zhì)在室溫保存或處理時(shí)極易被降解，且速度非?？?。為了防止染色質(zhì)的快速降解以及獲得具有良好可重復(fù)性的結(jié)果，保證在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中染色質(zhì)一直處于冰上。盡量避免反復(fù)凍融，制備完成后獨(dú)立分裝到小管中保存，可以幫助防止染色質(zhì)的降解。在Chromatrap?提供的試劑盒中，每個(gè)IP所需要的染色質(zhì)是極小量的，因此每一個(gè)獨(dú)立分裝的小管樣品可以提供多次ChIP實(shí)驗(yàn)所需的染色質(zhì)量。

正如上述提到的，染色質(zhì)的質(zhì)量在得到一個(gè)好的ChIP結(jié)果中起著關(guān)鍵性作用。為了保證較好的染色質(zhì)的質(zhì)量，細(xì)胞的交聯(lián)條件需要被不斷優(yōu)化。避免過度交聯(lián)細(xì)胞這一點(diǎn)尤為重要，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞耐受后續(xù)的裂解和超聲片段化。過度交聯(lián)細(xì)胞也會(huì)影響反交聯(lián)的效率（即交聯(lián)效果不能被有效地去除），這會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)過程（例如qPCR）。

Chromatrap?推薦使用1%的甲醛于培養(yǎng)基或PBS中交聯(lián)細(xì)胞，在室溫條件下于旋轉(zhuǎn)混勻器上交聯(lián)10分鐘即可。如果效果依舊不佳，可嘗試將交聯(lián)時(shí)間減少至5分鐘。

交聯(lián)細(xì)胞這一過程會(huì)影響所制備的染色質(zhì)的質(zhì)量從而影響整個(gè)ChIP實(shí)驗(yàn)。確保每次制備染色體的過程中使用的甲醛都是現(xiàn)配現(xiàn)用的，這也可以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有更好的可重復(fù)性。確保甲醛中沒有甲醇的污染，因?yàn)榧状伎梢云茐募?xì)胞膜從而改變交聯(lián)條件。

染色質(zhì)可以通過超聲處理（超聲波機(jī)械斷裂）或者酶解（微球菌核酸酶消化）的方式片段化。根據(jù)細(xì)胞的不同選擇合適的片段化方式是十分重要的。Chromatrap?可以依據(jù)片段化方法的不同提供相應(yīng)的試劑盒。我們也可以提供酶解片段化的優(yōu)化試劑盒。

在無法使用超聲處理或者為了盡可能減少對(duì)可被特異抗體識(shí)別的蛋白抗原表位的破壞的情況下，酶解片段化方法十分有效。然而，這種方法具有一定的偏好性，因?yàn)楹怂崦妇哂星懈钐囟ɑ蛐蛄械奶匦?。酶解片段化主要?yīng)用于非交聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀（Native ChIP）實(shí)驗(yàn)，在這個(gè)過程中，染色質(zhì)與蛋白質(zhì)并沒有被交聯(lián)，這時(shí)如果采用超聲處理來片段化染色質(zhì)將破壞染色質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用形成的復(fù)合物。一些細(xì)胞種類也許耐受裂解從而導(dǎo)致較差的酶解片段化效率，在這種情況下可以嘗試超聲處理來同時(shí)幫助細(xì)胞的裂解以及染色質(zhì)的片段化。

以下列出了超聲處理以及酶解片段化的優(yōu)缺點(diǎn)，供您優(yōu)化片段化過程中參考從而提高效率。